Nuôi cấy tế bào da ứng dụng trong điều trị bỏng và vết thương mạn tính
(08:47 | 03/07/2012)
  - Trong những thập niên gần đây, công nghệ nuôi cấy tế bào đã có nhiều bước phát triển mạnh mẽ và mang lại hiệu quả to lớn về điều trị trong y học.

Trong đó đáng kể nhất phải nói đến những ứng dụng của nuôi cấy tế bào da để điều trị bỏng và vết thương mạn tính. Nhờ thành tựu của công nghệ này, nhiều bệnh nhân bỏng nặng, bỏng sâu diện rộng đã được cứu sống, nhiều bệnh nhân bị các vết thương mạn tính đã được chữa khỏi. Không những thế, công nghệ nuôi cấy tế bào da còn góp phần cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân…

Đôi nét về lịch sử của công nghệ nuôi cấy tế bào da trên thế giới

Năm 1968 lần đầu tiên Marvin Karasek thực hiện nuôi và biệt hóa tế bào của da thỏ thành công, cho đến nay công nghệ nuôi cấy tế bào sừng và nguyên bào sợi có những bước tiến dài. Một trong những người có nhiều đóng góp nhất cho kĩ thuật nuôi cây là Green Howard (Hoa Kỳ). Năm 1978 ông đã tìm thấy sự liên quan giữa tế bào sừng và nguyên bào sợi trong quá trình nuôi cấy. Năm 1980, ông đã thành công khi cấy 1cm2 dây rốn, sau một thời gian nuôi cấy đã đạt 3m2 biểu bì. Với những cống hiến của mình và bằng sự kiện trên, ông được xem là ông tổ của kĩ thuật nuôi cấy tế bào sừng.

Mặc dù trong những thập niên 70, 80, công nghệ nuôi cấy tế bào sừng và nguyên bào sợi của da phát triển khá mạnh trên thế giới nhưng lại bộc lộ những hạn chế như tỉ lệ thành công không cao, thời gian nuôi cấy kéo dài, nhưng nguyên nhân chính làm cho công nghệ này không còn được “mặn mà” đó là khả năng ứng dụng thực tế có nhiều hạn chế và giá thành quá cao.

Công nghệ nuôi cấy tế bào da hiện nay

Nhìn thấy những yếu điểm chết người như đã nói ở phần trên, các nhà nghiên cứu và các nhà lâm sàng đã không ngừng tìm kiếm các giải pháp nhằm khắc phục các yếu điểm đó. Một trong những vấn đề then chốt nhằm tăng tính ứng dụng lâm sàng của các sản phẩm được tạo ra và giảm giá thành của sản phẩm hay nói cách khác là làm sao để nhiều người có cơ hội sử dụng các sản phẩm nuôi cây hơn, là phải cải tiến quy trình công nghệ. Kĩ thuật “kinh điển” được hiểu nôm na là các tế bào da (tế bào sừng, nguyên bào sợi …)  sau khi được tách từ mẫu da sẽ được đưa vào môi trường nuôi cấy trên các đĩa nuôi cấy, sau một thời gian (khác nhau tùy từng loại tế bào) từ một số tế bào ban đầu, các tế bào sẽ phát triển, nhân lên và liên kết với nhau để tạo nên các “màng” tế bào nuôi cấy, đây là sản phẩm cần đạt. Do sự liên kết giữa các bào rất mong manh, dễ vỡ, dễ đứt rách, hơn nữa việc đưa các màng tế bào này để ghép lên nền vết bỏng, vết thương mạn tính rất khó khăn, nên tỉ lệ thành công khi ghép các màng nuôi cấy trên lâm sàng thường không cao. Các màng này rất dễ bị tiêu hủy do nhiễm khuẩn và chất lượng liền sẹo cũng hạn chế. Ngoài ra việc phối hợp giữa labô nuôi cấy và lâm sàng cũng nhiều bất cập (ví dụ khi tế bào đa có thể ghép được thì vết thương lại chưa đủ điều kiện để ghép và ngược lại khi vết thương đủ điều kiện để ghép thì các tế bào chưa đủ tuổi hay mật độ cần thiết hoặc đã quá già để ghép). Chính những lý do trên đã đẩy giá thành lên rất cao và cơ hội ứng dụng sản phẩm rất thấp. Một trong những thay đổi lớn của công nghệ nuôi cấy tế bào da là việc tìm ra các giá đỡ để cho tế bào phát triển, nhân lên trên đó quá trình nuôi cấy. Thay vì chỉ nuôi cấy các tế bào trong môi trường nuôi cấy, trên đĩa nuôi cấy đơn thuần thì người ta cấy các tế bào trên một loại màng nền như là một giá đỡ cho tế bào. Các giá đỡ này phải đảm bảo là có thể sử dụng để đắp lên vết thương và cho phép các tế bào phát triển bình thường trên đó. Khi mật độ và tuổi của tế bào phù hợp ghép, người ta đưa cả tấm giá đỡ này cùng với các tế bào trên đó để ghép lên vết thương, vết bỏng. Nhờ phát minh này cùng với việc sử dụng các màng sinh học, các vật liệu che phủ vết thương tạm thời để chuẩn bị nền ghép mà tỉ lệ thành công và giá thành điều trị đã có những đột phá. Các giá đỡ được sử dụng là các màng collagen, một số màng tổng hợp, bán tổng hợp sử dụng trong điều trị vết thương…

Tại Viện Bỏng quốc gia, các nhà khoa học đã thành công trong công nghệ nuôi cấy nguyên bào sợi da đồng loại điều trị vết thương, vết bỏng bằng việc sử dụng tấm TegadermR (một loại điều trị vết thương thông thường) để làm giá đỡ cho tế bào, các nhà khoa học ở đây đã tạo ra được sản phẩm là tấm nguyên bào sợi nuôi cấy có chất lượng tương đương sản phẩm tương tự của các trung tâm trên thế giới nhưng giá thành chỉ thấp bằng 1/4. Đã có hàng trăm bệnh nhân bỏng và vết thương mạn tính được điều trị thành công bằng tấm nguyên bào sợi nuôi cấy. Hiện nay, Viện bỏng đang tiếp tục triển khai công nghệ nuôi cấy tế bào sừng da tư thân để điều trị bỏng nặng và các trường hợp chấn thương mất da lớn, dự kiến cuối năm 2007 sẽ có sản phẩm để sử dụng trên bệnh nhân.

Điều trị vết thương mạn tính bằng tế bào gốc

Nhng vết thương khó lành do h qu ca bng đơn gin hay nng hơn là x tr... có th điu tr được vi công ngh tế bào gc (Ảnh sưu tầm)

Không chỉ có các bước tiến trong công nghệ nuôi cấy, việc sử dụng các sản phẩm nuôi cấy cũng có nhiều thay đổi. Thay vì sử dụng đơn thuần các màng nguyên bào sợi, tế bào sừng nuôi cấy lên vết thương thì ngày nay người ta đã kết hợp việc nuôi cấy tế bào sừng để tạo lớp biểu bì lên chất nền trung bì là lớp nguyên bào sợi nuôi cấy - đó là công nghệ da nhân tạo do kết hợp lớp biểu bì nuôi cấy với một màng collagen, màng silicon hay một loại màng tổng hợp khác.

Những loại tế bào da được nuôi cấy phục vụ mục đích nghiên cứu

Trước hết phải kể đến nguyên bào sợi là loại tế bào của trung bì được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy điều trị vết thương, vết bỏng. Vì tính sinh miễn dịch thải ghép thấp cho nên có thể sử dụng nguyên bào sợi da đồng loại. Tác dụng của nguyên bào sợi nuôi cấy là thúc đẩy thời gian liền vết thương, làm liền vết thương bỏng nông, vết thương, vết loét mạn tính do nhiều nguyên nhân đặc biệt là vết thương do tia xạ. Trên vết bỏng sâu, nó có tác dụng làm liền vết bỏng hẹp, cải thiện chất lượng nền ghép cho việc ghép da hay ghép tế bào sừng nuôi cấy, cải thiện chất lượng liền sẹo, sử dụng trong phẫu thuật thẩm mỹ…

Tế bào sừng cũng là loại tế bào được sử đụng nhiều trong điều trị vết thương, vết bỏng  và phục vụ nhiều nghiên cứu khác. Tế bào sừng là tế bào thuộc biểu bì có tính sinh miễn dịch thải ghép cho nên phải sử dụng tế bào của da tự thân. Công nghệ nuôi cấy tế bào sừng khá phức tạp, một trong những ứng dụng quan trọng của nó là góp phần điều trị để cứu sống những bệnh nhân bỏng sâu diện tích lớn thiếu nguồn da ghép tự thân.

Ngoài ra, tế bào sắc tố da (melanocyte) - một loại tế bào thuộc biểu bì da, cũng đã được nuôi cấy điều trị một số bệnh về sắc tố da như bạch biến.

Kĩ thuật nuôi cấy nguyên bào sợi và tạo tấm nguyên bào sợi nuôi cấy tại Viện Bỏng Quốc gia

Nuôi cấy tế bào nói chung và nuôi cấy nguyên bào sợi nói riêng là một kĩ thuật phức tạp, đòi hỏi công nghệ cao. Quy trình nuôi cấy nuôi cấy nguyên bào sợi và tạo tấm nguyên bào sợi nuôi cấy được tiến hành tại Viện bỏng Quốc gia bao gồm các bước chính sau:

1. Chọn, sàng lọc người cho mẫu da: mẫu da được lấy ở những người tình nguyện, mạnh khỏe không mắc các bệnh lây nhiễm qua đường máu và các bệnh mạn tính khác. Người càng trẻ càng tốt, những người cho mẫu da đều được xét nghiệm toàn bộ để loại trừ các bệnh lý nói trên.

2. Lấy mẫu da và bảo quản mẫu da: vùng dự kiến lấy mẫu da được vệ sinh sạch sẽ, sát trùng trước khi lấy. Mẫu da lấy có toàn lớp biểu bì, trung ì, hạ bì, kích thuics khoảng 1-1,5cm2, thường lấy ở trong đùi sát nếp bẹn. Sau khi lấy mẫu da được bảo quản trong ống nghiệm chứa 5ml dung dịch DMEM (Dulbecos Modiffied Eage Media) chứa 1% kháng sinh, bảo quản ở 40C trong vòng 8h, sau đó chuyển mẫu da về labô nuôi cấy.

3. Xử lý mẫu da: các mẫu da được cắt lọc hết mỡ sau đó ngâm vào cồn 70% thể tích trong vòng 30 giây, lấy ra rửa sạch 3 lần bằng PBS rồi cắt nhỏ thành các mẩu da kích thước 0,1mm

4. Cấy mẫu da: các mẫu da được cấy trong chai nuôi cấy với mật độ một mẩu da 0,1mm cho diện tích 2,5cm2. Cho môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi vào chai rồi đặt vào tủ ấm 370C với 95% thể tích khí trời và 5% thể tích CO2. Tiến hành bổ sung môi trường nuôi cấy sau 24h và sau 48h tiếp theo. Thay môi trường sau 4 ngày, theo dõi tế bào mọc và di cư ra khỏi mẫu da. Khi nguyên bào sợi phát triển và nhân lên  đạt > 50% diện tích che phủ đáy chai nuôi cấy thì tiến hành tách tế bào.

5. Tách nguyên bào sợi: lấy bỏ mẫu da và rửa tế bào PBS (phosphate Buffered Salines), thêm dung dịch có 0,05% trypsin và 0,35mM EDTA trong PBS rồi đặt chai nuôi cấy vào tủ ấm 370 trong 5 phút. Sau đó kiểm tra mức độ tế bào tách khỏi đáy chai, khi các tế bào co tròn thì cho thêm môi trường nuôi cấy vào và lấy hỗn dịch nuôi cấy đó tiến hành ly tâm với tốc độ 1200v/phút, sau đó bỏ dịch nổi và thu lấy tế bào. Các tế bào này được đưa vào chai nuôi cấy với mật độ 5 × 103 tế bào/cm2.

6.  Nhân rộng nguyên bào sợi: sau một thời gian các tế bào nhân lên trong đĩa nuôi cấy sẽ được cấy chuyển sang các chai khác với mật độ 5000 tế bào/cm2, quy trình cấy chuyển cần theo dõi chặt chẽ tình trạng ô nhiễm, mật độ tế bào, pH môi trường. Các tế bào nuôi cấy và nhân rộng trong môi trường nuôi cấy và đặt trong tủ ấm CO2, cần thay môi trường nuôi cấy cho tế bào sau 3-4 ngày.

7. Thu hoạch nguyên bào sợi: lựa chọn thế hệ tế bào từ P5-P10, các tế bào đó phải sống và phát triển bình thường. Kiểm tra vi khuẩn và nấm trước khi thu hoạch. Tiến hành thu tế bào từ chai nuôi cấy bằng cách dùng trypsin và ly tâm.

8. Chuẩn bị giá đỡ tế bào: giá đỡ tế bào có thể là collagen, các màng sinh học hay tổng hợp. Tại viện bỏng sử dụng tấm vật liệu điều trị vết thương là TegadermR. Giá đỡ được cắt tròn có diện tích đĩa nuôi cấy (75cm2) khử trùng giá đỡ và đặt vào đĩa nuôi cấy, sau đó cho môi trường nuôi cấy vào sao cho láng ngập đều giá đỡ.

9. Cấy tế bào lên giá đỡ: đếm tế bào và tính mật độ tế bào rồi dàn đều hỗn dịch tế bào vừa thu được lên giá đỡ đã chuẩn bị. Đặt đĩa nuôi cấy có giá đỡ và tế bào vào tủ nuôi cấy 370C có 5% Co2 trong khoảng 1h rồi bổ sung môi trường nuôi cấy cho đủ 5ml.

10. Theo dõi và đánh giá tấm tế bào nuôi cấy: các nguyên bào sợi sẽ nhân lên và phát triển trên giá đỡ trong môi trường nuôi cấy. Theo dõi mật độ tế bào đủ lớn và không có tình trạng nhiễm khuẩn, nhiễm nấm thì tiến hành ghép tấm tế bào nuôi cấy đó lên vết thương, vết bỏng đã được chuẩn bị.

(Ảnh sưu tầm)

Thông thường thời gian từ khi lấy mẫu da đến khi có thể ghép tấm nguyên bào sợi nuôi cấy lên vết thương, vết bỏng khoảng 2 tuần. Các kĩ thuật nuôi cấy các bào da khác cũng có quy trình gần giống như trên, tuy nhiên môi trường nuôi cấy, hóa chất sử dụng và nhiều chi tiết kĩ thuật khác với nuôi cấy nguyên bào sợi.

Sử dụng tế bào mầm từ dây rốn trẻ sơ sinh - bước đột phá trong công nghệ nuôi cấy tế bào ứng dụng điều trị vết thương, vết bỏng.

Tế bào mầm (stem cell) đã được nhắc đến nhiều trong những năm gần đây. Công nghệ tế bào mầm ngày càng có nhiều ứng dụng, đặc biệt trong y học. Việc sử dụng tế bào mầm từ dây rốn trẻ sơ sinh (bản quyền của PGS.TS. Phan Toàn Thắng và cộng sự - Đại học quốc gia Singapore) đã mở ra một triển vọng to lớn về ứng dụng của công nghệ nuôi cấy tế bào. Khác với các tế bào đã nói ở trên là những tế bào đã biệt hóa cao, tế bào mầm dây rốn trẻ sơ sinh là những tế bào biệt hóa thấp, khả năng sinh sản phát triển mạnh. Do đó khả năng thành công sẽ cao hơn, thời gian nuôi cấy sẽ được rút ngắn. Quan trọng hơn các nhà “sản xuất” trên labô và các nhà lâm sàng có thể chủ động trong việc “thu hoạch” sản phẩm ở nhiều giai đoạn, nhiều thời kỳ nên tính khả thi khi áp dụng trên lâm sàng sẽ cao hơn. Từ các tế bào mầm dây rốn trẻ sơ sinh người ta có thể tạo ra các sản phẩm để điều trị vết bỏng, vết thương mạn tính (tế bào sừng, nguyên bào sợi), tạo ra các tế bào giác mạc trong nhãn khoa, tạo ra các tế bào biểu mô đường hô hấp… Hiện nay, Viện bỏng quốc gia đang hợp tác với PGS.TS Nguyễn Toàn Thắng và các đồng nghiệp Singapore để triển khai kĩ thuật này. Hy vọng trong một thời gian ngắn, các bệnh nhân bị bỏng và vết thương mạn tính sẽ được sử dụng các sản phẩm công nghệ cao từ công nghệ này.

TS. Nguyễn Viết Lượng

Viện bỏng Quốc gia

(TTVN số 8)

bỏng, vết thương, tế bào…

   
Tìm kiếm bài Viết
Xem bài Theo ngày Tháng
   
 
Các tin khác
Trang    1       2     Next